Myndinneign: khawfangenvi16/shutterstock.com
High-performance vökvaskiljun eða háþrýsti vökvaskiljun (HPLC) er litskiljunaraðferð sem er notuð til að aðgreina blöndu efnasambanda í greiningarefnafræði og lífefnafræði til að bera kennsl á, magngreina eða hreinsa einstaka efnisþætti blöndunnar.
Reversed-phase HPLC eða Ultra-high Performance Liquid Chromatography (UHPLC) er almennt notaður aðskilnaðarhamur. Það veitir kraftmikla varðveislu efnasambanda sem hafa vatnsfælin og lífræna virkni. Sambland af vatnsfælnum og van der Waals gerð víxlverkana á milli allra markefnasambandsins og bæði kyrrstöðu og hreyfanlegra fasa gerir kleift að halda þessum efnasamböndum með öfugum fasa.

Hvernig virkar HPLC?

Í mjög litlu magni er sýnisblandan sem á að skilja og prófuð send í straum af hreyfanlegum fasa sem sígur í gegnum súlu. Það eru mismunandi gerðir af súlum fáanlegar með ísogsefnum af mismunandi kornastærðum og mismunandi yfirborði.
Blandan fer í gegnum súluna á mismunandi hraða og hefur samskipti við sorpefnið, einnig þekkt sem kyrrstæður fasi. Hraði hvers efnisþáttar í blöndunni fer eftir 1) efnafræðilegu eðli hans, 2) eðli súlunnar og 3) samsetningu hreyfifasans. Tíminn þegar tiltekið greiniefni kemur úr súlunni er kallaður varðveislutími þess. Varðveislutíminn er mældur við sérstakar aðstæður og talinn auðkennandi eiginleiki tiltekins greiniefnis.
Sogefnisagnir gætu verið vatnsfælnar eða skautaðar í eðli sínu. Venjulega notuðu farsímafasarnir innihalda hvers kyns blandanleg blöndu af vatni og lífrænum leysum eins og asetónítríl og metanóli. Einnig er hægt að nota vatnslausa farsímafasa.
Vatnshluti hreyfanlegra fasans gæti innihaldið sýrur eins og maura-, fosfór- eða tríflúorediksýru eða sölt til að gera aðskilnað sýnisþáttanna kleift. Samsetningu farsímafasans er annaðhvort haldið sem föstu eða eins mismunandi meðan á litskiljunargreiningunni stendur. Stöðug nálgun er áhrifarík fyrir aðskilnað sýnishluta sem eru ekki mjög ólíkir hvað varðar skyldleika þeirra við kyrrstæða fasann. Í hinni fjölbreyttu nálgun er samsetning farsímafasans mismunandi frá lágum til háum skolunarstyrk. Skolunarstyrkur hreyfanlegra fasans endurspeglast af varðveislutíma greiniefna þar sem hár skolunarstyrkur framkallar hraða skolun.

Tengdar sögur

  • RoHS og WEEE prófun — Greining á hættulegum efnum í raf- og rafeindabúnaði af LSM Analytical Services
  • Jónaskiljun — RoHS prófun á hættulegum efnum í rafeindabúnaði af LSM greiningarþjónustu
  • Acrylonitrile Butadiene Styrene — ABS High Impact High Heat

Samsetning farsímafasans er valin á grundvelli styrks víxlverkana milli nokkurra sýnishluta og kyrrstæða fasans.
HPLC skiptingarferlið er nokkuð svipað og vökva-vökva útdráttarferlið nema að hið fyrra er samfellt ferli, ólíkt því síðarnefnda sem er þrepaskipt ferli. Mælt er með því að prófa skiptingarferli séu framkvæmd til að ákvarða nákvæma HPLC aðferð sem myndi veita fullnægjandi aðskilnað.

Framleiðendur HPLC kerfa

Það er mikið úrval af HPLC valkostum á markaðnum í dag. Eftirfarandi er listi yfir ýmsa HPLC kerfisframleiðendur með stuttri kynningu á vörum þeirra:

  • Dionex, fyrirtæki byggt á vísindum litskiljunar, framleiðir UltiMate® 3000 Rapid Separation LC kerfið, UltiMate 3000 RSLCnano kerfið og Corona® fjölskyldu alhliða úðaskynjara.
  • Jasco Analytical Instruments bjóða upp á úrval af HPLC kerfum. LC-2000 Plus Series HPLC kerfið er einstaklega stillanlegt. Með miklum afköstum og litlum tilkostnaði er hægt að aðlaga þessi HPLC kerfi að nánast hvaða kröfu sem er, allt frá einföldum ísókratískum QA til háþróaðrar þróunar á mörgum leysiefnum/fjölsúlum. Isocratic LC-2000plus-Iso er með dælu, gashreinsitæki, sjálfvirka sýnatökutæki og UV/Vis skynjara. Dælan er hönnuð með rennslishraða frá 1µL til 10mL/mín við þrýsting allt að 500 bör til notkunar með 2, 3, 4, 6 og allt að 10 mm ID dálkum. Binary Gradient LC-2000plus-HPG er svipað og ísókratíska kerfinu en er með tveggja leysis halladælustillingu. Rennsli dælunnar er samhæft við 1 mm súlur. Quarternary Gradient LC-2000plus-LPG er líka svipað og ísókratíska kerfinu; Hins vegar er þetta líkan útbúið með quaternary halladælustillingu fyrir hámarks sveigjanleika leysis.
  • Preparative HPLC System frá Gilson hefur breitt flæðisvið sem hægt er að aðlaga fyrir bæði hálfundirbúandi og undirbúningsaðskilnað. Hátt dæluafl þess gerir kleift að búa til fjölbreytt úrval af undirbúningssúlustærðum. Kerfið er hannað með nýju skolstöðvakerfi sem samanstendur af rennandi þvottaþvotti og leyfir notkun á allt að tveimur mismunandi skolleysiefnum.
  • Sharp™ HPLC kerfi frá AAPPTec eru með dælum sem eru örgjörvustýrðar og gera þannig mjög nákvæma og mjög nákvæma flæðishraða, sem getur hjálpað til við að fá framúrskarandi greiningargetu og hæstu mælingarnákvæmni.

Aðrir framleiðendur á núverandi markaði eru Agilent, Beckman Coulter, Bio-Rad og Buck Scientific.

Kostir HPLC

Helstu kostir HPLC kerfa eru sem hér segir:

  • Stjórnar og gerir sjálfvirkan litskiljunarbúnað
  • Veitir gagnastjórnun, öryggiseiginleika og skýrslugerð og sannprófun tækja.
  • Öflugur og aðlögunarhæfur
  • Eykur framleiðni með því að stjórna öllum greiningarsviðum – frá sýni til tækis og frá aðskilnaði til að tilkynna niðurstöður.
  • Á viðráðanlegu verði

Umsóknir um HPLC

Megintilgangur HPLC tækninnar er að bera kennsl á, magngreina og hreinsa tiltekið greiniefni eða efnasamband. Hægt er að gera bæði megindlega og eigindlega greiningu. Hægt er að nota HPLC í eftirfarandi forritum:

  • Vatnshreinsun
  • Greining á óhreinindum í lyfjaiðnaði
  • Forstyrkur snefilhluta
  • Ligand-exchange litskiljun
  • Jónaskiptaskiljun próteina
  • Há-pH anjónaskiptaskiljun á kolvetnum og fásykrum

Hágæða vökvaskiljun HPLC

Heimildir og frekari lestur

  • Reversed Phase HPLC/UHPLC Chromatography-Phenomenex
  • Dionex vörur-Dionex
  • HPLC Systems-aapptec
  • Undirbúnings HPLC System-Gilson

Þessi grein var uppfærð 22. apríl , 2019.
Fyrirvari: Skoðanir sem settar eru fram hér eru skoðanir höfundar sem eru settar fram í einkahlutverki sínu og eru ekki endilega fulltrúar skoðana AZoM.com Limited T/A AZoNetwork eiganda og rekstraraðila þessarar vefsíðu. Þessi fyrirvari er hluti af notkunarskilmálum þessarar vefsíðu.
 

Kynning á HPLC

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) er ferli til að aðskilja íhluti í vökvablöndu. Vökvasýni er sprautað í leysistraum ( hreyfanlegur fasi ) sem flæðir í gegnum súlu sem er pakkað með aðskilnaðarmiðli ( kyrrstæður fasi ). Sýnishlutir aðskiljast hver frá öðrum með  mismunadrifsferli  þegar þeir flæða í gegnum súluna.

Þegar bönd koma út úr súlunni flytur flæði þau til eins eða fleiri skynjara sem gefa spennusvar sem fall af tíma. Þetta er kallað  litskiljun . Fyrir hvern topp, tíminn þegar hann kemur fram auðkennir sýnishlutann með tilliti til staðals. Flatarmál toppsins táknar magnið.

Grunn HPLC kerfishlutir


Solvent Degasser  – fjarlægir lofttegundir úr leysunum þegar þær streyma til HPLC dælunnar
HPLC dæla  – veitir leysiflæði og hlutföll
Autosampler  – dregur sýni úr hettuglösum og sprautar þeim í leysisflæðið sem dælan gefur.
Skynjari  – bregst við aðskildum greiningarefnum sem koma út úr HPLC súlunni og framleiðir merki fyrir hugbúnaðinn
Súluofn  – hýsir HPLC súluna og heldur stöðugu hitastigi til að hægt sé að endurskapa aðskilnað

Isocratic vs. Gradient Elution Modes

Ísókratísk úthreinsun

  • Ein samsetning leysiefna er notuð meðan á aðskilnaði stendur
  • Seinni skolunartoppar eru breiðari en fyrri skolunartoppar vegna dreifingar
  • Gera verður ráðstafanir til að skola súluna reglulega með meiri leysistyrk til að hreinsa hana af óleysanlegum efnum sem safnast upp við sýnissprautun

Gradient Elution

  • Samsetningu leysiefna er breytt annað hvort stöðugt eða í skrefum
  • Almennt séð eru toppar skarpari í gegnum litskiljunina miðað við ísókratíska skolun
  • Sumar aðskilnaður getur náðst sem ekki er mögulegur með ísókratískri skolun
  • Rekstrartími litskiljunar getur verið styttri í samanburði við ísókratísk skolun

Ísókratísk og hallalosunardælastilling

Ísókratísk dæla

Einrásardæla sem krefst þess að notandinn forblandar farsímafasann. Samsetningin helst stöðug með tímanum.

Kvartlæg lágþrýstistigadæla

4 rása dæla sem býr til blöndur af aðskildum leysirásum undir hugbúnaðarstýringu. Blöndun er gerð áður en dæluhausarnir fara. Samsetning getur breyst með tímanum.

Tvöfaldur háþrýstistigadæla

2ja rása dæla sem býr til blöndur af 2 leysiefnum undir hugbúnaðarstýringu. Blöndun er gerð eftir dæluhausana. Samsetning getur breyst með tímanum.
LC dálkur sem mælt er með:
Dálkaefnafræði: td C18, C8, C4, Phenyl-Hexyl, Biphenyl
Dálkasnið: 100 x 3 mm, 2,7 til 5 µm agnir

Skimunarstuðull – Öflugur fyrir aðferðaþróun



Túlkun: Fyrir öfugfasa LC súlu þar sem A er vatn og B er lífrænt sýnir þessi fyrsta keyrsla sýnishlutar sem eru allir skautaðir. Þannig að aðskilnaðurinn er lélegur vegna þess að efnin upplifa litla skiptingu á kyrrstöðufasanum. Með öðrum orðum, veika byrjunarleysisástandið færir sýnishlutana of snemma af.

Til að valda því að efnin skiptist meira í kyrrstæða fasann minnkum við halla hallans þannig að hreyfanlegur fasastyrkur eykst ekki eins hratt. Efnin haldast lengur og byrja að aðskiljast hvert frá öðru. Taktu eftir að við „skolum“ enn súlunni með sterkum leysi í lok hlaupsins til að hreinsa súluna á áhrifaríkan hátt.

Við minnkum hallahallann aftur þar til við byrjum að sjá góðan aðskilnað innan tímaramma.

Tiltækir skynjarar fyrir HPLC

UV/Vis skynjarar

  • Svarar litningagreiningum á bilinu 190 – 800nm
  • Vöktun á einni bylgjulengd
  • Gott fyrir meirihluta lífrænna greiningarefna
  • Gradient elution samhæft

Photodiode Array (PDA) skynjarar

  • Svarar litningagreiningum á bilinu 190 – 800nm
  • Vöktun á mörgum bylgjulengdum
  • Fullkomið litrófssnið af litskiljunartoppum
  • Gott fyrir meirihluta lífrænna greiningarefna
  • Gradient elution samhæft

>> UV vs Diode-Array (PDA) skynjarar fyrir (U)HPLC – samanburður

Flúrljómunarskynjarar

  • Svarar aðeins greiniefnum sem flúrljóma náttúrulega eða hægt er að láta flúrljóma með afleiðumyndun
  • Einstaklega viðkvæm
  • Gradient elution samhæft

Brotstuðullskynjarar

  • Talinn alhliða skynjari fyrir öll greiniefni
  • Tiltölulega óviðkvæmt
  • Ekki samhæft við hallaskolun

Uppgufunarljósdreifingarskynjarar

  • Talinn næstum alhliða skynjari, sem svarar bæði litninga og ólitningagreiningum
  • Gott næmi
  • Gradient elution samhæft

Massagreiningarskynjarar

  • Mismunandi skynjari
  • Skilar fjöldaupplýsingum til greiningarauðkennis og skýringar á uppbyggingu
  • Mjög viðkvæm
  • Gradient elution samhæft

HPLC dálkar

Hefðbundnar HPLC súlur eru pakkaðar með gljúpum kísilögnum

Athugasemdir þegar þú velur dálk

Ákvörðun um „besta“ kyrrstæða fasa fyrir aðskilnað ætti að byggjast á leysni sýnis og efnafræðilegum mun á sýnisþáttunum.

  • Leysanlegt í lífrænum eða vatnskenndum leysum?
  • Þekking á starfrænum hópum? -OH; -COOH; -CONH2; -C6H6 osfrv.

Ákvörðun um stærð súlunnar ætti að byggjast á markmiðum litskiljunar.

  • Ályktun mikilvægra kjósenda? – lengra súlurúm
  • Fljótleg greining? – styttra súlurúm
  • Hámarksupplausn fyrir alla? – smærri agnir
  • Lágmarka notkun leysiefna? – mjórra innra þvermál

Besti kosturinn gæti verið málamiðlun mismunandi markmiða!

Efnafræði tengdra fasa

Tengt fasa pökkunarmiðill byrjar með beru kísilyfirborði

Með efnahvörfum næst viðhengi á aðaltengda fasanum.

Framleiðendur vísa til magns bundinnar fasaþekju í skilmálar af % kolefnishleðslu.

Mikið af kísilyfirborðinu er enn óhvarfað – sumir yfirborðssilanólhópar eru enn óvarðir.

Oft truflar aukatengiþrep smærri „endalok“ sameindir á milli frumtengdu fasaþráðanna. Þessar endalokar geta verið skautaðar eða óskautaðar.

Mismunandi súlur af sömu bundnu fasagerð munu vera mismunandi hvað varðar útsetningu fyrir síanóli og endalokum, sem leiðir til margvíslegra heildarskauta og mismunandi aðskilnaðargetu.

  • C18
  • C8
  • Fenýl
  • Bíhenýl
  • Alkýl amíð
  • Sýanóprópýl
  • Pentaflúorfenýl própýl
  • Amínó própýl

Val á dálki efnafræði byggt á leysni sýnis

Fyrirbærið vatnsfælin varðveisla

Svokallaðar öfugfasa súlur hafa bundinn fasa á yfirborði kísilagnanna sem er vatnsfælinn í eðli sínu. Dæmi eru C30, C18, C8, C4.
Í grundvallaratriðum, “eins og leysist upp eins og”. Slík súla mun hafa tilhneigingu til að halda sýnisþáttum sem einnig eru vatnsfælnir, svo framarlega sem hreyfanlegur fasi er ekki sterkari í aðdráttarafl sínu fyrir þann sýnishluta. Fleiri pólar sýnisþættir munu hafa tilhneigingu til að skolast hraðar út úr súlunni vegna þess að þeir haldast í minna mæli.
Fyrir öfugfasa súlu, notaðu blöndu af leysiefnum sem gefa heildar “meiri” pólun (minna vatnsfæln) en kyrrstæðu fasinn. Þannig hafa sýnisþættirnir ástæðu til að dragast að kyrrstæða fasanum (súlubundinn fasi) og standast tilhneigingu til að flæða með hreyfanlegum fasa (leysi).
Notaðu „veikasta“ eða skautaðasta ástandið sem nauðsynlegt er til að greina á milli sýnisþátta þegar þeir flytjast í gegnum súluna.
Dæmi um algeng leysiefnapör í hreyfanlegum fasa eru asetónítríl/vatn og metanól/vatn. Breyting á hlutfalli lífræns/vatns breytir heildarskautun þess.

Dæmi um vatnsfælna varðveislu

Eftirfarandi sameindir eru auðveldlega aðskildar á öfugfasa C8 súlu með því að nota 50/50 asetónítríl/vatn. Skautaða alanínið skolast fyrst úr súlunni og síðan óskautaða terfenýlið.

  • 1,1′:3′,1»-terfenýl vatnsfælnt eða óskautað
  • alanín vatnssækið eða skautað

  • HPLC vs UHPLC – Hvernig á að velja? 


Aftur í Index

 
 

  • Yfirlit yfir HPLC 
  • Tæki HPLC 
  • HPLC aðskilnaður 
  • Hvernig á að lesa litskiljun 

1 Yfirlit yfir HPLC

HPLC er skammstöfun fyrir High Performance Liquid Chromatography. „Litskiljun“ er tækni til aðskilnaðar, „skiljun“ er afleiðing af litskiljun og „skiljun“ er tækið sem notað er til að framkvæma litskiljun.
Meðal hinna ýmsu tækni sem þróuð er fyrir litskiljun, eru tæki tileinkuð sameindaaðskilnaði sem kallast súlur og afkastamikil dælur til að skila leysi við stöðugt flæðishraða, sumir af lykilþáttum litskiljunar. Eftir því sem tengd tækni varð flóknari varð kerfið sem almennt er nefnt High Performance Liquid Chromatography einfaldlega kallað „LC“. Nú á dögum hefur Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC), sem er fær um háhraðagreiningu, einnig orðið útbreiddari.
Aðeins er hægt að greina efnasambönd sem eru leyst upp í leysum með HPLC. HPLC skilur efnasambönd uppleyst í vökvasýni og gerir eigindlega og megindlega greiningu á því hvaða efnisþættir og hversu mikið af hverjum þætti er að finna í sýninu.
Mynd 1 sýnir grunnyfirlit yfir HPLC ferlið. Leysirinn sem notaður er til að aðgreina íhluti í vökvasýni fyrir HPLC greiningu er kallaður hreyfanlegur fasi. Hreyfanlegur fasi er afhentur í aðskilnaðarsúlu, annars þekktur sem kyrrstæður fasi, og síðan í skynjarann ​​með stöðugum flæðishraða sem stjórnað er af leysisdælunni. Ákveðnu magni af sýni er sprautað í súluna og efnasamböndin sem eru í sýninu eru aðskilin. Efnasamböndin sem aðskilin eru í súlunni eru greind með skynjara neðan við súluna og hvert efnasamband er auðkennt og magnmælt.

Mynd.1 Yfirlit yfir HPLC

2 Tæki HPLC

Nú hefur verið farið yfir „Grundvallaryfirlit yfir HPLC ferli“ (Eins og sýnt er á mynd 1) og aðferðum þess. Ef farið er í frekari smáatriði samanstendur HPLC af ýmsum íhlutum, þar á meðal leysisdælu, afgasunareiningu, sýnisspraututæki, súluofni, skynjara og gagnavinnsluvél. Mynd 2 sýnir HPLC flæðiritið og hlutverk hvers íhluta.

Mynd 2 HPLC flæðirit
Hvað varðar HPLC, þá skilar dælan hreyfanlegum fasa með stýrðum flæðishraða(a). Loft getur auðveldlega leyst upp í hreyfanlegum fasa við staðlaða loftþrýstinginn sem við búum í. Ef hreyfanlegur fasinn inniheldur loftbólur og fer inn í dæluna, geta vandamál eins og flæðissveiflur og grunnhávaði/rek komið fram. Afgasunareiningin hjálpar til við að koma í veg fyrir þetta vandamál með því að fjarlægja loftbólur í farsímafasa (b). Eftir að uppleysta loftið hefur verið fjarlægt er hreyfanlegur fasi afhentur í súluna. Sýnasprautan setur síðan staðlaða lausn eða sýnislausn inn í farsímafasann (c). Hitastigssveiflur geta haft áhrif á aðskilnað efnasambanda í súlunni. Súlan er sett í súluofn til að halda hitastigi stöðugu(d). Efnasambönd sem eru skoluð úr súlunni eru greind með skynjara sem er komið fyrir neðan við súluna (e). Vinnustöð vinnur úr merkinu frá skynjaranum til að fá litskiljun til að bera kennsl á og magngreina efnasamböndin (f).

3 HPLC aðskilnaður

HPLC getur aðskilið og greint hvert efnasamband með mismun á hraða hvers efnasambands í gegnum súluna. Mynd 3 sýnir dæmi um HPLC aðskilnað.
Það eru tveir áfangar fyrir HPLC: farsímafasinn og kyrrstæðufasinn. Hreyfanlegur fasi er vökvinn sem leysir upp markefnasambandið. Kyrrstöðufasinn er sá hluti súlu sem hefur samskipti við markefnasambandið.
Í dálknum, því meiri skyldleiki (td van der waals kraftur) milli íhlutans og hreyfanlega fasans, því hraðar færist íhluturinn í gegnum súluna ásamt hreyfanlegu fasanum. Á hinn bóginn, því sterkari skyldleiki við kyrrstæða fasann, því hægar fer hann í gegnum súluna. Mynd 3 sýnir dæmi þar sem guli hlutinn hefur sterka sækni við hreyfanlega fasann og færist hratt í gegnum súluna, en bleiki hlutinn hefur sterka skyldleika við kyrrstæða fasann og fer hægt í gegn. Skolunarhraði í súlunni fer eftir sækni milli efnasambandsins og kyrrstöðu fasans.

Mynd 3 Dæmi um HPLC aðskilnað

4 Hvernig á að lesa litskiljun

Orðið «chromatogram» þýðir samsæri sem fæst með litskiljun. Mynd 4 sýnir dæmi um litskiljun. Litskiljunin er tvívídd teikning þar sem lóðrétti ásinn sýnir styrk með tilliti til styrkleika skynjaramerkja og lárétti ásinn sýnir greiningartímann. Þegar engin efnasambönd eru skoluð út úr súlunni er lína samsíða lárétta ásnum teiknuð. Þetta er kallað grunnlína. Skynjarinn svarar miðað við styrk markefnasambandsins í skolunarsviðinu. Söguþráðurinn sem fæst er meira eins og lögun bjöllu frekar en þríhyrningur. Þetta form er kallað „toppur“.
Retention time (tR) er tímabilið á milli inndælingarpunkts sýnis og topps toppsins. Tíminn sem þarf fyrir efnasambönd sem ekki eru geymd (efnasambönd sem hafa engin víxlverkun fyrir kyrrstæða fasann) til að fara frá inndælingartækinu að skynjaranum er kallaður dauður tími (t0).
Topphæðin (h) er lóðrétt fjarlægð milli topps tinds og grunnlínu, og toppsvæðið (A) litað með ljósbláu er svæðið sem er umlukið af toppnum og grunnlínunni. Þessar niðurstöður verða notaðar við eigindlega og megindlega greiningu á íhlutum sýnis.

Mynd.4 Litskiljun og tengd hugtök

  • Shimadzu hefur lengi verið að auka greiningargetu HPLC kerfa.
  • Samhliða vaxandi ákalli um bætta vinnu skilvirkni og sveigjanlegri vinnustíl, eru hugmyndir um LC greiningu að breytast.

 
Kynning
High-performance vökvaskiljun (HPLC) er öflug aðskilnaðartækni sem notuð er við greiningu á jónum, próteinum og lífrænum sameindum. HPLC er byggt á aðferðum aðsogs, skiptingar og jónaskipta, sem fer eftir gerð kyrrstöðufasa sem notuð er. Tæknin felur í sér fastan kyrrstæða fasa, venjulega lokað í ryðfríu stáli súlu, og fljótandi hreyfanlegur fasa. Áhugaverðar sameindir eru aðskildar út frá muninum á hlutfallslegum dreifingarhlutföllum uppleystra efna milli fasanna tveggja. HPLC er mikið notað til að meta hreinleika og til að ákvarða innihald hugsanlegra lyfjasameinda. Það er einnig hægt að nota til að ákvarða handhverfa samsetningu, með því að nota breytta hreyfanlegu fasa eða kiral kyrrstæða fasa.
Á áttunda áratugnum var hugtakið High-performance vökvaskiljun (HPLC) kynnt til að greina nútíma háþrýstitækni frá klassískri lágþrýstingssúluskiljun. HPLC hefur mörg forrit á sviði réttar, lífefnafræði, klínískra vísinda, næringarefna, umhverfisvísinda og lyfja. Hægt væri að nota hágæða vökvaskiljun sem greiningartækni fyrir lyfjaprófanir eða magngreiningu á líffræðilegum þáttum fyrir klínískar rannsóknir.

Meginregla

Hágæða vökvaskiljunin virkar á þeirri meginreglu að sumir þættir sýnisins eru lengri en aðrir að fara í gegnum litskiljunarsúluna. Tíminn sem sameindirnar taka fer eftir sækni sameindarinnar við hreyfanlega fasa (vökva eða gas) og kyrrstæða fasa (fast eða fljótandi). Þeir sem hafa meiri skyldleika við kyrrstæða fasann eru lengur að fara í gegnum súluna og öfugt.

Tæki

Búnaðurinn samanstendur af dælukerfi, inndælingarloka, litskiljunarsúlu, kyrrstæðum og hreyfanlegum fasum, tengirörum, skynjara og gagnasöfnunartæki. Dælan er notuð til að tryggja stillanlegt, stöðugt og endurgeranlegt flæði upp á 1,0 ml/mín í greiningarsúluna. Inndælingartækið setur þröngan straum af breytilegu og endurskapanlegu sýnisrúmmáli ofan á greiningarsúluna. Ákjósanlegu magni greiniefnisins er haldið í greiningarsúlunni við viðunandi þrýstingsfall. Skynjarinn veitir kerfinu mikla næmni, línuleika og langtímastöðugleika til að greina merki frá litskiljunarsúlunni. Gagnasöfnunartækið aflar, geymir gögn og framkvæmir útreikninga. Þessir útreikningar eru notaðir til að stjórna og stilla rekstrarfæribreytur og aðskilnaðarskilyrði.

Bókun

Undirbúningur fyrir farsímafasa

  1. Bætið 400 ml af asetónítríl við um það bil 1,5 lítra af hreinsuðu afjónuðu vatni.
  2. Bætið ísediki (2,4 ml) við þessa lausn.
  3. Lausnin er þynnt með hreinsuðu afjónuðu vatni þannig að heildarrúmmálið verði 2,0 L í mæliflösku. pH lausnarinnar sem myndast ætti að vera á bilinu 2,8 til 3,2.
  4. Bætið við 40% natríumhýdroxíði til að stilla pH í 4,2.
  5. Síaðu hreyfanlega fasann undir lofttæmi til að fjarlægja gasið og föst efni sem gætu stíflað litskiljunarsúluna úr lausninni.

Undirbúningur íhlutalausnar
Gerðu lausn sýnisins í samræmi við kröfur íhlutanna sem þarf að aðskilja.
Að búa til staðlaðar lausnir

  1. Látið hæfilegt magn af hverjum innihaldsefni renna í 50 ml mæliflösku.
  2. Þynnið stofnlausnirnar að 50 ml merkinu á mæliflöskunum með hreyfanlegum fasa.
  3. Hellið hverri staðallausn í lítil hettuglös.
  4. Geymið sýnin í kæli ásamt lausnunum sem eftir eru.

Athugaðu stillingar HPLC kerfisins

  1. Gakktu úr skugga um að úrgangslínan sé í úrgangsílátinu.
  2. Stilltu flæðihraða farsímafasans á 0,5 ml/mín.
  3. Stilltu lágmarks- og hámarksþrýsting og flæðihraða á rétt gildi á framhlið dælunnar.
  4. Stilltu lágmarksþrýstinginn á 250 psi.
  5. Stilltu hámarksþrýstinginn á 4.000 psi.
  6. Ýttu á „núll“ á framhlið skynjarans til að stilla á hreinan farsímafasa.
  7. Skolaðu 100 µL sprautu með afjónuðu vatni, þvoðu hana síðan með nokkrum rúmmálum af íhlutalausnum sem á að greina og fylltu sprautuna.

Sýnasprautun og gagnasöfnun

  1. Sprautaðu hægt 100 µL af lausninni með handfangi inndælingartækisins í hleðslustöðu í gegnum skilrúmsportið.
  2. Stilltu gagnasöfnunarforritið til að safna gögnum í 300 sekúndur, til að fá 3 toppana til að skolast út í gegnum skynjarann.
  3. Áður en tilraunin er hafin skaltu snúa inndælingarhandfanginu í inndælingarstöðu og smella strax á „Start Trial“ í tölvugagnasöfnunarforritinu.
  4. Þegar 300 sekúndur eru liðnar sendir gagnasöfnunin merki um að vista gagnaskrána.
  5. Athugaðu tímann í sekúndum fyrir hámark hverrar prufu til að bera kennsl á hvern íhlut.
  6. Fjarlægðu sprautuna úr skilrúminu og framkvæmdu ferlið fyrir hvern af þeim vinnustöðlum sem eftir eru.

Útreikningar

  1. Reiknaðu styrk allra efnisþáttanna í sýnislausninni.
  2. Ákvarðu toppsvæðin á litskiljunum fyrir hvern staðal og óþekktu sýnin með þríhyrningsaðferðinni, sem er jöfn topphæð sinnum breidd við ½ hæð
  3. Ákvarðu tímann sem íhlutirnir taka til að ná toppunum.
  4. Teiknaðu kvörðunarferla fyrir toppflatarmál á móti styrk (mg/L) fyrir alla íhluti.
  5. Reiknaðu minnstu ferninga sem passa fyrir kvörðunarferla.
Umsóknir

Magngreining sýklalyfja (Ehle., Yoshikawa., Schotz., & Guze., 1978)
Háþrýstivökvaskiljun var notuð til magngreiningar á cephalothin og desacetylcephalothin í sermi. Bæði efnasamböndin voru dregin út úr sermi með dímetýlformamíði. Lyfin voru aðskilin með öfugfasaskiljun og greind með útfjólubláu ljósi frásogs við 254 nm, og sermisþéttni cephalothins og desacetylcephalothins mældist allt að 1,0 jig/ml. Engin truflun frásogs fannst í útdrætti úr sermisýnum frá venjulegum einstaklingum og sjúklingum sem fengu ýmis önnur lyf, þar á meðal hin sýklalyfin. Borinn var saman styrkur sýklalyfjanna sem ákvarðaður var með efnaaðferðinni og örverugreiningunni í sýnum úr mönnum. Fylgnistuðullinn (r) reyndist vera 0,96 í sýni úr mönnum, en hjá hundum var r-gildið 0,79. Háþrýstivökvaskiljunin gerir kleift að ákvarða lyfjahvörf cephalothins, desacetylcephalothins og annarra sýklalyfja í framtíðinni. Tæknin er næm, sértæk, nákvæm og hröð og virðist hentug fyrir venjubundnar klínískar rannsóknir.
Greining á þvottaefnisleysanlegum samþættum himnupróteinum (Berridge., o.fl., 2011)
High-performance vökvaskiljun (HPLC) hefur verið notuð til að greina ósnortinn massa, þvottaefnisleysanleg og hreinsuð samþætt himnuprótein með metanóli sem notað er sem lífræni hreyfanlegur fasi. Himnuprótein og þvottaefni voru aðskilin með litskiljun á ísókratískum stigum hallasniðs frá 150 mm C3 öfugfasa súlu. Tæknin veitti 10-falt lægra næmi sem krafðist 0,2-5 lg af próteini. Aðferðin er einnig samhæf við staðlaða vökvaskiljun-massagreiningu (LC–MS) sem er notuð til ósnortinna massagreiningar á leysanlegum próteinum. Rannsóknin staðfesti að hægt væri að beita aðferðinni á fjölnotendatæki eða í umhverfi með mikilli afköst fyrir greiningu og mat á himnupróteinum. Auðvelt er að samþætta aðferðina í venjubundnar tilraunir og tækni sem notuð er fyrir bæði leysanleg prótein og himnuprótein.
Uppgötvun og magngreining á frumu c-di-GMP (Petrova. & Sauer., 2017)
Mótun bis-(30, 50)-hringlaga dímerískt gúanósín mónófosfat (c-di-GMP) gildi er mikilvægt fyrir stjórnun á ýmsum ferlum í bakteríutegundum. Rannsókn á c-di-GMP reglugerð krefst sérstakra og áreiðanlegra aðferða við mat á c-di-GMP magni og veltu. Afkastamikil vökvaskiljun er orðin almennt notuð tækni til að ná þessum markmiðum. c-di-GMP var dregið úr Pseudomonas aeruginosa sýnum og var greint og magnmælt með HPLC. Aðferðin er hæf fyrir breytingum fyrir greiningu á c-di-GMP í öðrum bakteríutegundum.
Greining á þvagi fyrir cysteini, cysteinylglycine og homocysteine ​​(Kuśmierek., Głowacki., & Bald., 2006)
Þrír helstu þvagþíólin: cystein, cysteinylglycine og homocysteine ​​voru mæld og greind með háþrýstivökvaskiljun. Þvag var minnkað með natríumbórhýdríði, til að breyta tvísúlfíðum í þíól sem síðan voru afleidd með 2-klór-1-metýlkínólíníum tetraflúorbórat. Tæknin gerði áreiðanlega samtímis ákvörðun á amínóþíólum í þvagi. Kvörðunargrafin voru fengin fyrir venjulegt þvag með auknu magni cysteins, cysteinylglycine og homocysteins. Greiningin var 98–100% endurheimtanleg og næmi var 0,12–0,25 μmól. Rannsóknin sýndi að hægt væri að nota hágæða vökvaskiljun sem greiningartækni fyrir þvagsjúkdóma.
Varúðarráðstafanir

  • Notaðu HPLC-gráðu vatn og áreiðanleg leysiefni fyrir aðgerðina.
  • Notaðu sömu blöndunaraðferðina mörgum sinnum til að koma í veg fyrir villur af völdum hita við blöndunina.
  • Eftir að leysiefnin hafa verið blandað skal lofttæmissía farsímafasann til að fjarlægja öll sviflausn óhreininda sem gætu stíflað súluna og þar með haft áhrif á flæðishraða farsímafasans.
  • Afgasaðu HPLC farsímafasanum fyrir notkun til að koma í veg fyrir loftbólumyndun.
  • Forðist óhóflega afgasun þar sem það gæti valdið tapi á rokgjörnum hlutum hreyfanlegra fasablöndunnar.
  • Þvoið súluna og dælu með vatni til að koma í veg fyrir útfellingu á föstum kristallum sem gæti leitt til stíflna í súlunni og hraðari slits á dæluíhlutum.
Styrkleikar og takmarkanir
  • Afkastamikil vökvaskiljun er afar fljótleg og skilvirk í samanburði við aðrar litskiljunaraðferðir.
  • Ferlið tekur 10 til 30 mínútur að meðaltali og skilar hárri upplausn. Það er mjög nákvæm og endurskapanleg aðskilnaðartækni fyrir lífrænar sameindir.
  • HPLC krefst lágmarksþjálfunar og inniheldur sjálfvirkan búnað.
  • HPLC er fjölhæf og afar nákvæm greiningaraðferð til að bera kennsl á og magngreina efnafræðilega hluti.
  • Kostir HPLC fela í sér kröfuna um litla úrtaksstærð, breytingar eftir því hversu mikil magngreining er nauðsynleg og áreiðanleiki niðurstaðna.
  • Þrátt fyrir kosti þess gæti það verið dýrt og krefst mikið magn af dýrum lífrænum efnum.
Heimildir
  1. Berridge., R. Chalk., ND’Avanzo., L. Dong., D. Doyle., J. Kim., . . . Gileadi., O. (2011). Hágæða vökvaskiljun aðskilnaður og ósnortinn massagreining á þvottaefnisleysanlegum samþættum himnupróteinum. Anal Biochem, 410(2), 272-280.
  2. IN Ehle., TT Yoshikawa., MC Schotz., & Guze., a. L. (1978). Magngreining sýklalyfja með háþrýstivökvaskiljun: Cephalothin. Antimicrob Agents Chemother, 13(2), 221-227.
  3. Kuśmierek., R. Głowacki., & Bald., E. (2006). Greining á þvagi fyrir cysteini, cysteinylglycine og homocysteine ​​með vökvaskiljun með mikilli afkastagetu. Anal Bioanal Chem, 385(5), 855-60.
  4. E. Petrova., & Sauer., K. (2017). High-performance vökvaskiljun (HPLC) byggt uppgötvun og magngreining á frumu c-di-GMP. Aðferðir Mol Biol, 1657, 33-43.